Collagénase from Clostridium histolyticum

La collagénase a été utilisée dans la préparation de tissus artériels pour l'étude des produits finaux de glycosylation avancée (AGE). L'enzyme a également servi, en association avec d'autres protéases, à la désagrégation de tissus de tumeur humaine, de rein de souris, de cerveau humain, d'épithélium de poumon et de nombreux autres tissus. Elle se révèle efficace dans des études de perfusion hépatique et rénale, la digestion de pancréas et l'isolement d'hépatocytes non parenchymateux. L'enzyme fait l'objet d'essais pour évaluer sa capacité à provoquer la libération d'hépatocytes, à une concentration d'environ 1 mg/ml dans un volume total de 100 ml pour chaque foie de rat.

Ce produit peut être utilisé pour préparer des suspensions de cellules individuelles en vue d'un séquençage.

La collagénase issue de Clostridium histolyticum a été utilisée :

• dans la préparation d'une solution de collagénase destinée à la digestion de tissus tumoraux.
• comme supplément dans une solution saline tamponnée au phosphate servant à la digestion de tissus graisseux mésentériques extirpés.
• comme supplément dans le milieu RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) pour la digestion de segments de côlon.
• pour la digestion de tissus d'endomètre.
• dans la préparation d'une enzyme A et d'une enzyme B en vue de la digestion de testicules décapsulés.

La collagénase est activée à l′aide de quatre atome-grammes de calcium par mole d′enzyme. Elle est inhibée par l′acide éthylèneglycol-bis(bêta-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique, le bêta-mercaptoéthanol, le glutathion, l′acide thioglycolique et la 8-hydroxyquinoline.

La libération efficace de cellules à partir d'un tissu nécessite l'action de collagénases et de la protéase neutre. La collagénase est activée à l'aide de quatre atome-grammes de calcium (Ca²⁺) par mole d'enzyme. On pense que le filtrat de culture contient au moins 7 protéases différentes, de poids moléculaires allant de 68 à 130 kDa. Le pH optimal se situe entre 6,3 et 8,8. L'enzyme est typiquement utilisée pour digérer les constituants conjonctifs d'échantillons tissulaires afin de libérer des cellules individuelles. Le traitement par une collagénase peut provoquer la mort de certaines cellules. La digestion nécessite généralement des concentrations de 0,1 à 5 mg/ml. La durée de réaction varie de 15 minutes à plusieurs heures et permet de dissocier convenablement les cellules sans trop provoquer de mort cellulaire. Utiliser de préférence un tampon de Krebs Ringer additionné de calcium et de BSA, et du Zn²⁺ pour l'activité.

Clostridium histolyticum produit deux classes de collagénases. Les collagénases clostridiennes sont plus efficaces que les collagénases de mammifères. Elles clivent la triple hélice de collagène en plusieurs sites de clivage. Les collagénases clostridiennes sont impliquées dans l'invasion bactérienne durant la gangrène gazeuse.

Les solutions sont habituellement préparées à une concentration de 1-2 mg/ml dans du tampon TESCA (TES 50 mM, chlorure de calcium 0,36 mM, pH 7,4 à 37 °C).
Ce produit présente également des activités clostripaïne, protéase neutre et triptyque.

Une unité de digestion de collagène (UDC) libère une quantité de peptides à partir du collagène d′un tendon d′Achille de bovin équivalant, en termes de couleur avec la méthode à la ninhydrine, à 1,0 μmole de leucine en 5 heures à pH 7,4 et à 37 °C en présence d′ions calcium. Une unité d′hydrolyse de FALGPA hydrolyse 1,0 μmole de furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala par minute à 25 °C. Une unité de protéase neutre hydrolyse la caséine et produit une couleur équivalente à 1,0 μmole de tyrosine en 5 heures à pH 7,5 et à 37 °C. Une unité de clostripaïne hydrolyse 1,0 μmole de BAEE par minute à pH 7,6 et à 25 °C en présence de DTT.

Dans son emballage d'origine, ce produit est stable pendant six ans à -20 °C. Aucune perte de l'activité FALGPA ou protéase n'est observée après 30 jours à 37 °C, 50 °C et -20 °C. Les solutions de collagénase brute sont stables lorsqu'elles sont congelées rapidement en aliquotes (à 10 mg/ml) et conservées à -20 °C. Tout cycle de congélation/décongélation supplémentaire détériore la solution. Le produit conserve 100 % de son activité pendant 7 heures lorsqu'il est placé sur de la glace.